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    接下來為你講解ELISA檢測流程之夾心法

    發布時間: 2022-06-25  點擊次數: 314次
     
      ELISA檢測樣本包括血清、血漿、尿液、胸腹水、灌洗液、腦脊液、細胞培養上清、組織勻漿等標本,靈敏度*。在收集標本前都必須有一個完整的計劃,必須清楚要檢測的成份是否足夠穩定。我們提倡新鮮標本盡早檢測,對收集后當天就進行檢測的標本,及時儲存在49C備用,如有特殊原因需要周期收集標本,請造模取材后,將標本及時分裝后放在20℃或70°C條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差,蛋白極易降解,直接影響實驗質量,所以避免反復凍融。
      ELISA檢測之夾心法:
      1、加樣:將標準品工作液依次加入到前兩列孔中,每個濃度的工作液并列加兩孔,每孔100μL。待測樣品加入到其他孔,每孔100μL(若樣本濃度高于檢測范圍,需用標準品&樣本稀釋液稀釋后取樣)。給酶標板覆膜,37℃孵育90分鐘。提示:加樣時將樣品加于酶標板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,避免產生氣泡。加樣時間宜控制在10分鐘內。
      2、s物素化抗體/抗原:棄去液體,甩干,不用洗滌。每個孔中立即加入物素化抗體/抗原工作液100μL,混勻,酶標板加上覆膜,37℃孵育1小時。
      3、洗滌:甩盡孔內液體,每孔加洗滌液350μL,浸泡1-2分鐘,吸去或甩掉酶標板內的液體,在厚的吸水紙上拍干。重復此洗板步驟3次。提示:此處與其他洗板步驟都可用洗板機。每一步洗滌充分是實驗的根本。
      4、HRP酶結合物:每孔加酶結合物工作液100μL,混勻,加上覆膜,37℃孵育30分鐘。
      5、洗滌:棄去孔內液體,洗板5次,方法同步驟3。
      6、底物:每孔加底物溶液(TMB)90μL,混勻,加上覆膜,37℃避光孵育15分鐘左右。提示:根據實際顯色情況酌情縮短或延長孵育時間,但不可超過30分鐘。當標準孔出現明顯梯度時,即可終止。
      7、終止:每孔加終止液50μL,終止反應。提示:終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。
      8、讀值:立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。應提前打開酶標儀預熱,設置好檢測程序。
      9、實驗完畢后,將未用完的試劑按規定的保存溫度放回冰箱保存至保質期。
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